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Microscopie confocale

Microscopie confocale pour l’étude in vivo de la cornée

La microscopie confocale  permet d’observer in vivo les différentes composantes du tissu cornéen : épithélium, plexus nerveux sous épithélial, stroma et endothélium.

La couche de Bowman et la membrane de Descemet ne peuvent pas être visualisées directement avec la microscopie confocale, du moins pour les cornées saines.

La microscopie confocale s’effectue sous anesthésie locale, et son principe est relativement simple. Le microscpoe confocal effectue un balayage permanent d’une section coronale de la cornée, où il éclaire une petite portion de tissu qui est observée de manière « confocale », en « filtrant » spatialement la lumière diffusée par les couches de tissus en arrière et en avant de la couche inspectée.

Un des premiers instruments disponibles était le microscope « Confoscan ». Actuellement, on peut utiliser le rétinographe Heidelberg, qui reprend les principes de la microscopie confocale en utilisant une lumière laser (longueur d’onde : 633 m). Initialement destiné à l’étude du tissu rétinien, il peut être transformé en un microscope confocal cornéen de haute résolution, muni d’un adaptateur particulier (Rostock corneal module).

Microscopie confocale par balayage laser : un émetteur fournit une lumière laser qui éclaire la surface, en étant concentrée par une lentille qui balaie la surface. Un système de sténopé (pinhole en anglais) est positionné devant l’émetteur et le détecteur dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif (plans confocaux). Ainsi, seuls les photons provenant du plan focal passent le sténopé et participent à la formation de l’image : les photons provenant des plans situés en avant ou en arrière (ex: pointillés violets) sont stoppés par le sténopé. Ce système de plans confocaux donne son nom à ce type de microscopie. Comme la lumière provenant des plans adjacents (floue car défocalisée) est stoppée, on obtient une coupe optique nette. En balayant la cornée, on fait varier le plan et on obtient une succession de coupes, situées à différentes profondeur.

Les images fournies ont une densité spatiale de 384 x 384 point image (le côté de l’image mesure 400 micron) et la magnification est de X 63. La résolution est limitée par le double passage aller et retour, en utilisant les propriétés de la seule diffraction, le calcul du diamètre de la tache centrale d’Airy est au moins égal à 2.44x 633, soit une résolution latérale minimale de 1,5 microns environ.

Etude de la cornée par microscopie confocale

Cette étude offre la possibilité de visualiser les structures dont les dimensions sont de quelques microns.

 

Epithélium cornéen

L’épithélium de la cornée humaine est composé de 5 ou 6 couches de cellules, dont la morphologie varie de la superficie vers la profondeur : les plus superficielles sont aplaties, les cellules intermédiaires sont polygonales, et les cellules basales (une assise cellulaire) sont cylindriques. La densité des cellules superficielles varie entre 500 et 2000 cellules par mm2. La densité des cellules basales varie entre 4000 et 7000 cellules par mm2. L’épaisseur cornéenne centrale moyenne est proche de 50 microns.

 

microscopie confocale de l'épithélium cornéen superficiel

Les cellules épithéliales superficielles sont polygonales et irrégulières.

Les cellules basales de l’épithélium cornéen sont plus petites, et de géométrie plus régulière

Plexus nerveux sous épithélial

L’innervation de la cornée dépend des nerfs ciliaires longs, qui proviennent de la branche ophtalmique du nerf trijumeau. Les rameaux de nerfs pénètrent la cornée par le limbe, et forment un plexus (réseau) stromal profond, qui est anastomosé avec un plexus sous basal et sous épithélial superficiel. Le plexus nerveux sous basal (en avant de la couche de Bowman) et sous épithélial (en arrière de la couche de Bowman) peut être étudié in vivo grâce à la microscopie confocale. On observe généralement des fibres nerveuses fines et brillantes, d’une épaisseur comprise entre 4 et 6 microns.

Plexus basal sous épithélial : les fibres ont un aspect brillant et sont inter connectées.

 

Stroma

Le stroma cornéen représente 90% de l’épaisseur de la cornée ; sur le plan structurel, on peut le scinder en 3 compartiments : cellulaire, extracellulaire, et neurosensriel.  Le compartiment cellulaire est essentiellement composé de kératocytes, dont le volume total n’est qu’approximativement que 5% du volume cornéen total. Les 95% restant comportent les lamelles collagène (surtout de type I) et la substance interstitielle, et les fibres nerveuses isolées ou organisées en plexus.  En microscopie confocale, on ne peut pas véritablement observer les structures acellulaires qui sont transparentes à la lumière ! Les corps réflectifs brillants que l’on observe généralement sont ceux des noyaux des kératocytes, qui se détachent au sein d’un fond sombre (matrice extracellulaire). La densité moyenne des kératocytes est plus importante en superficie (600 à 1600 cellules par mm2.) qu’en profondeur (500 à 1000 cellules par mm2. La morphologie des noyaux cellulaires varie en fonction de la profondeur : plus arrondis en superficie, plus ovalaire en profondeur. Quand ces kératocytes sont « activés », leur activité métabolique leur procure un aspect particulièrement brillant.

cornée HRT microscopie confocale : aspect du stroma superficiel

Stroma cornéen superficiel: noter la densité des kératocytes.

cornée HRT microscopie confocale : aspect du stroma moyen

Microscopie confocale: aspect du stroma cornéen moyen.

cornée HRT microscopie confocale aspect du stroma postérieur

Microscopie confocale du stroma postérieur

 

Endothélium

La densité en cellules endothéliales est maximale à la naissance (jusqu’à 7500 cellules par mm2), puis décline pour atteindre une valeur moyenne proche de 2700 cellules par mm2 chez les adultes jeunes (1600 à 3200 cellules par mm2). Si la densité des cellules endothéliales décline en deçà de 500 cellules par mm2, la décompensation cornéenne est à redouter. Le pourtour des cellules endothéliales saines est hexagonal, et leur taille relativement homogène (la surface d’une cellule peut varier entre 200 et 500 nanomètre carrés). Certains processus pathologiques comme la dystrophie de Fuchs peuvent entraîner une modification de cette géométrie, ou l’apparition de cellules de tailles variable.

cornée HRT microscopie confocale aspec de l' endothélium

Microscopie spéculaire confocale: aspect de l’endothélium cornéen sain. Noter la géométrie hexagonale du pourtour des cellules endothéliales, et leur taille régulière.

 Dystrophies cornéennes

Les dystrophies cornéennes représentent un large éventail de pathologies non inflammatoires et dégénératives e la cornée: elles constituent un vaste champ d’application pour la microscopie cornéenne confocale in vivo: cette technique est utile au diagnostic objectif et à la compréhension des altérations des structures cornéennes concernées.

Dystrophie de Cogan

La dystrophie de Cogan est la plus fréquente des dystrophies cornéennes. Elle est héréditaire, mais il existe des formes sporadiques. Elle affecte un pourcentage non négligeable de la population ; celui-ci est variable selon les études, mais est au moins de 2%. Elle affecte les deux yeux et concerne le contingent épithélial de la cornée. Les symptômes de la dystrophie de Cogan sont liés à des  érosions récidivantes de l’épithélium cornéen. Elles peuvent apparaître de manière spontanée à l’adolescence, ou être secondaire à un traumatisme direct même léger : doigts dans l’œil, éraflure par une feuille de papier ou de plante, accident de maquillage, etc. Typiquement, un larmoiement et des douleurs lancinantes oculaires réveillent le patient vers le petit matin. L’examen au biomicroscope (lampe à fente) révèle des lésions superficielles linéaires et grisatres, dont les contours peuvent évoquer selon l’imagination des cartes de géographies, des empreintes de doigts, ou des petits kystes.

A cette description imagée bi dimensionnelle, la microscopie confocale a apporté des éléments objectifs et « tri dimensionnels ». La dystrophie de Cogan est liée à une fabrication anormale de la membrane basale de l’épithélium. Au lieu d’être tendue sous  les cellules basales de l’épithélium, cette tunique présente de multiples expansions intra épithéliales ;  de fait, l’adhérence de l’épithélium basal est réduite, ce qui explique la survenue d’érosions répétées. Les cellules épithéliales migrent de manière anormales, et peuvent être prisonnières des replis de membrane basale.

 microscopie confocale dystrophie basale Cogan (HRT)

Images en microscopie spéculaire confocale (HRT 2) de l’épithélium d’une cornée atteinte de dystrophie de Cogan symptomatique. En haut à drpote, l’examen biomicroscopique permet de visualiser des images classiques: empreintes digitales , contours en carte de géographie et micro kystes. Des coupes coronales réalisées à différentes épaisseurs de la couche épithéliale retrouvent les empreintes linéaires de la membrane basale anormale, qui présente de nombreuses expansions et plis.

Le traitement de la dystrophie de Cogan débute par la prescription d’agents mouillants et lubrifiants. En cas de persistance de symtômes invalidants, une photokératectomie à visée thérapeutique (PTK ou PKT) peut être effectuée grâce au laser excimer. Ce traitement à une grande efficacité et permet souvent de supprimer les crises, ou d’en réduire la fréquence et l’importance.

Dystrophie de Schnyder

La dystrophie cristalline de Schnyder est une dystrophie cornéenne héréditaire rare. Ses formes cliniques sont diverses, de même que ses manifestations; parfois silencieuse, parfois source de baisse d’acuité visuelle.

Décrite pour la première fois en 1924 par Van Went et Wibaut, elle est définie en 1929 par Schnyder comme une entité héréditaire individualisée. Elle se caractérise classiquement par la présence d’opacités cornéennes centrales bilatérales en disque ou en anneau, constitués de lipides tels que le cholestérol sous formes de cristaux. Nous avons rapporté une forme annulaire sans cristaux, de découverte fortuite.

dystrophie  de Schnyder: HRT

Aspects en microscopie confocale in vivo réalisée à l’aide du module cornéen du HRTII (300m × 300m). (A) Aspect remanié
de la couche de Bowman (flèche). (B) Examen du stroma qui apparaît remanié avec destruction du plexus nerveux sous-épithélial. (C) Image en coupe montrant l’épithélium (a), la couche de Bowman (flèche) et le stroma remaniés (c). (D) Examen de l’endothélium avec présence d’un matériel anormal hyper-réflectif entre les cellules endothéliales.

La dystrophie de Groenouw de type I (dystrophie granulaire de la cornée)

La dystrophie de Groenouw de type I (dystrophie granulaire de la cornée) est une affection héréditaire, qui concerne le stroma de la cornée. Elle est liée à la présence d’une mutation au niveau d’un gène (TGFBI) situé sur le chromosome 5q31 qui est responsable de la formation de kératoépithéline.

Il s’agit d’une affection autosomique dominante: l’atteinte d’un parent peut suffire à transmettre la maladie. Elle est généralement découverte dans l’enfance ou à l’adolescence, où l’on observe au niveau de la cornée centrale des dépots blanchatres ou translucides épars, dont l’aspect fait un peu penser à des miettes de pain. Ces dépôts sont situés dans la partie antérieure du stroma cornéen, sous la couche de Bowman qu’ils peuvent parfois perforer. La vision peut être progressivement atteinte en raison de la diffusion et l’irrégularité provoquée par ces lésions, qui peuvent également entrainer certains symptômes comme la photophobie, ou des douleurs superficielles oculaires récidivantes.

Les dépôts sont constitués de protéines non collagéniques, hyper réflectives. Ils atteignent rarement le limbe sauf dans des formes très avancées.

 

Aspect  biomicroscopique et en microscopie confocale de la dystrophie granulaire (Groenouw I). Les dépôts hyperréflexifs sont bien visibles. En microscopie optique, ces dépôts hyalins adopteraient une coloration rouge vif en utlisant un colorant dit « trichrome de Masson ».

Aspect biomicroscopique et en microscopie confocale de la dystrophie granulaire (Groenouw I). Les dépôts hyperréflexifs sont bien visibles. En microscopie optique, ces dépôts hyalins adopteraient une coloration rouge vif en utlisant un colorant dit « trichrome de Masson ».

2 réponses à “Microscopie confocale”

  1. Thierry Bonnefoix dit :

    Bonjour Dr Gatinel,
    Vous m’avez vu en consultation en 2015 pour un avis pour une retouche lasik pour hypermétropie, que vous m’avez déconseillée en raison d »érosions cornéennes suite à la PKR de surface que j’avais eu en 1998 pour myopie.
    Pour l’instant je n’ai donc rien fait.
    Ma question : Est-ce qu’une en étude microscopie confocale permettrait d’avoir une indication supplémentaire concernant le risque opératoire en cas de lasik (récurrence d »érosions). D’autre part, une OCT cornéenne aurait-elle un intérêt (une publication récente semble le montrer – (Diez-Feijóo, Cornéa, 2015, 34(3) 290-295)
    Cordialement – Dr Thierry Bonnefoix – CHU GHrenoble

  2. Dr Damien Gatinel dit :

    La microscopie confocale est une technique qui permet de réaliser des images en coupe du tissu cornéen à une échelle « histologique », mais elle ne permet pas de valider des indications (ou d’invalider des contre indications) fondées sur des données et une expérience clinique antérieures à la généralisation de cette technologie. Les études comme celles que vous rapportez sont un pas dans cette direction, mais dans votre cas, elle ne pourrait fournir assez de certitudes pour vous proposer une intervention non risquée.

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